A veces la sífilis ha sido llamada "el gran imitador" porque sus primeros síntomas son similares a los de muchas otras enfermedades. Las personas sexualmente activas deben consultar a un médico ante cualquier erupción cutánea o llaga en el área genital. Las personas que han sido tratadas por otra ETS, como la gonorrea, deben realizarse exámenes para asegurarse de que no tienen sífilis.

Hay tres formas de diagnosticar la sífilis:

1. el reconocimiento de los signos y síntomas por parte de un médico
2. la identificación microscópica de la bacteria de la sífilis
3. análisis de sangre

Generalmente el médico usa estos abordajes para detectar la sífilis y decidir cuál es la etapa de la infección.

Para diagnosticar la sífilis identificando la bacteria, el médico realiza un raspado de la superficie de la úlcera o chancro y la examina en un microscopio especial de "campo oscuro" para detectar el organismo. Los análisis de sangre también brindan evidencias de la infección, aunque pueden dar resultados de falso-negativo (no muestran los signos de la infección a pesar de su presencia) durante hasta tres meses después de la infección. También pueden ocurrir resultados de falso-positivo, por lo tanto, generalmente se realizan dos análisis de sangre. La interpretación de los análisis de sangre de sífilis pueden ser difíciles y a veces se necesita repetir los análisis para confirmar el diagnóstico.

Los exámenes de sangre que por lo general se usan para detectar la evidencia de sífilis son el examen VDRL (siglas en inglés que corresponden a Venereal Disease Research Laboratory, laboratorio de investigación de enfermedades venéreas) y el RPR (siglas en inglés que corresponden a reagina rápida en plasma). Los resultados de falso positivo (muestran signos de la infección cuando no está presente) ocurren en personas con trastornos autoinmunes, ciertas infecciones virales y otras afecciones.

Por lo tanto, un médico administrará un análisis de sangre de confirmación cuando el análisis inicial es positivo. Estos análisis incluyen la prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes (FTA-ABS) que puede detectar con precisión entre el 70 y el 90 por ciento de los casos. Otro examen específico es el ensayo de hemaglutinación del treponema pallidum (TPHA). Estos exámenes detectan los anticuerpos de la sífilis (proteínas que produce el sistema inmunológico de una persona para combatir la infección). No sirven para diagnosticar un caso nuevo de sífilis en pacientes que ya han tenido la enfermedad previamente porque una vez que los anticuerpos se forman, permanecen en el cuerpo durante muchos años. Sin embargo, estos anticuerpos, no protegen de una nueva infección de sífilis. En algunos pacientes con sífilis (en especial en las etapas de latencia o en las últimas estapas), se puede hacer una punción lumbar para comprobar si hay infección en el sistema nervioso.